哈佛大学刘如谦教授团队在蛋白质工程领域取得突破性进展，相关成果发表于《自然》期刊。该研究通过人工智能驱动的蛋白质设计结合实验室连续进化技术，成功开发出针对非天然靶点且具备高稳定性、高催化效率和高特异性的蛋白酶，为蛋白质科学开辟了新的研究范式。
传统蛋白质工程通常以天然酶作为定向进化的起点，但天然酶本身存在稳定性不足的问题，经过人工改造或实验室进化的蛋白质又常面临活性与特异性难以兼顾的困境。研究团队创新性地提出"先设计稳定性，再进化功能"的工作流程：首先利用AI蛋白质设计模型ProteinMPNN对天然蛋白酶进行序列重构，在保留关键催化位点的基础上重新生成其他氨基酸序列，并通过AlphaFold2预测蛋白质结构；随后以AI设计变体和天然蛋白酶为起点，开展噬菌体辅助连续进化（PACE）实验，筛选具有新功能的突变体。
以肉毒杆菌神经毒素E型（BoNT/E）为模型的研究显示，AI设计的D1、D2和D3变体在保持天然底物切割能力的同时，最高催化效率达到野生型的2.8倍。当这些稳定化变体作为PACE进化的起点时，在三个难度递增的新底物（415、413和412）上均表现出显著优势：特别是在最难切割的底物412上，AI设计变体的进化成功率达到100%，而天然酶仅50%；前者变体的PACE回路激活倍数达16-20倍，远高于天然酶变体的约10倍。突变互换实验进一步证实，部分有益突变仅在AI设计背景下有效，无法直接应用于天然酶。
研究团队将该策略拓展至其他蛋白酶时同样取得成功。针对PTEN切割变体E(4130)A2存在的表达量低、稳定性差问题，将PACE进化获得的突变移植到AI设计的D1-D3变体中，新蛋白酶在保持PTEN切割特异性的同时，大肠杆菌表达量提升2.2-5.2倍，HEK293T细胞表达量更提高超过24倍。在开发ataxin-2靶向蛋白酶的过程中，AI设计起点产生的变体切割速度比天然酶进化变体快1.4-1.7倍，且未检测到对天然底物SNAP25的切割活性，细胞实验也显示其副产物更少。
该研究通过整合计算设计与连续进化技术，显著扩展了蛋白酶的进化空间。以底物413为例，AI设计变体D3在进化过程中富集了天然酶中罕见的突变组合，证明重新设计起点能够探索不同的功能序列空间。替代起点实验进一步验证了该策略的普适性：ProteinMPNN设计的D4变体初始催化速度虽比天然酶低20倍，但经过PACE进化后仍能达到相当甚至更高的活性水平。
尽管成果显著，研究团队也指出当前方法存在局限性。该策略目前主要在BoNT/E蛋白酶体系中验证，其他蛋白质是否适用仍需更多实验；ataxin-2靶向蛋白酶尚处于工具酶开发阶段，其治疗神经退行性疾病的潜力有待进一步研究；在安全性方面，针对非天然靶标的蛋白酶需要系统评估脱靶效应、细胞毒性和免疫原性等问题。这些发现为开发新型治疗蛋白和功能酶提供了重要技术路径，相关技术细节已完整披露于原始论文。
