细胞凋亡作为生命科学领域的关键研究内容，是细胞遵循内在程序主动走向死亡的过程，对维持机体稳态和调控发育起着核心作用。准确检测细胞凋亡，是基础生物学与临床病理学研究的重要基石。在众多检测方法中，末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记法（TUNEL）凭借独特优势，成为原位标记凋亡细胞的“金标准”技术。
细胞凋亡过程由一系列紧密调控的生化级联事件驱动。当凋亡的关键执行者半胱天冬酶（Caspases）被激活后，其下游的核酸内切酶（如CAD/DFF40）也会活化。这些酶会特异性切割染色质DNA，先产生50 - 300 kb的大片段，再以核小体为单位（约180 - 200 bp）规律性地切断双链DNA，形成众多带有游离粘性3’ - 羟基（-OH）末端的DNA片段，这是凋亡晚期区别于坏死、焦亡等其他死亡方式的典型分子标志。
TUNEL技术的原理基于一种特殊的DNA聚合酶——末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）。与依赖模板的普通DNA聚合酶不同，TdT可不依赖模板，将单个脱氧核苷酸（dNTP）随机且连续地添加到双链或单链DNA的3’ - OH末端。在实验中，把荧光素（如FITC、Cy3）、生物素或地高辛标记的脱氧尿苷三磷酸（如FITC - dUTP或BrdUTP）作为底物提供给TdT酶，该酶就能高效地将这些标记的核苷酸共价连接到凋亡细胞DNA断裂处暴露的3’ - OH末端，形成带有可检测标签的探针尾巴。
这种标记方式具有极高的特异性。正常活细胞或处于增殖周期的细胞，其染色质DNA结构完整，极少暴露3’ - OH末端；坏死细胞虽也有DNA随机断裂，但断裂模式与凋亡不同且数量相对较少。通过检测这些标记信号，可在单细胞水平上，对组织切片或培养细胞中的凋亡细胞进行原位、可视化的定位与定量分析。后续根据标记物类型，可采用荧光显微镜直接观察（荧光法），或通过酶促显色系统（如辣根过氧化物酶 - HRP或碱性磷酸酶 - AP结合底物DAB显色）后在普通光学显微镜下观察（显色法）。
要成功进行TUNEL检测，严谨且优化的实验操作至关重要，其核心流程包括样本预处理、通透、标记反应与检测分析四个阶段。样本制备与固定环节，不同类型样本处理方式不同。石蜡切片需进行标准的二甲苯脱蜡和梯度乙醇水化；冰冻切片和细胞样本（爬片、涂片）通常用4%多聚甲醛（PFA）缓冲液室温固定15 - 30分钟。固定环节不仅能保存细胞形态，还能终止内源性核酸酶活性，防止DNA进一步降解，固定剂的选择和时间控制直接影响后续标记效率。
通透与内源性酶封闭步骤，是为让TdT酶和标记底物能顺利进入细胞核接触DNA，需对细胞膜/核膜进行适度通透，常用方法是使用0.1% - 0.5% Triton X - 100或蛋白酶K（20 μg/mL）处理。蛋白酶K处理时间需通过预实验精确摸索，时间过短通透不足，信号微弱；时间过长易导致组织或细胞脱落，还可能破坏核酸结构产生假阳性。对于血细胞丰富或内源性过氧化物酶活性强的组织，若采用HRP - DAB显色法，通透后需进行内源性过氧化物酶封闭，以降低非特异性背景。
TUNEL标记反应是实验核心步骤，需严格按照试剂盒说明书，将TdT酶与标记的dUTP（如FITC - dUTP）按比例混合，配制成反应工作液（现配现用，冰上暂存）。滴加工作液至样本区域，加盖玻片或置于湿盒中，37°C避光孵育（通常60 - 120分钟）。此过程中要设置关键对照，阴性对照（反应液中不加TdT酶或仅用缓冲液）用于监测非特异性结合背景；阳性对照（用DNase I预处理样本，人为诱导DNA随机断裂）用于验证整个检测体系的有效性。
信号检测与复染封片环节，对于荧光法，反应结束后用PBS充分洗涤去除未结合试剂，然后进行细胞核复染，常用DAPI（4’,6 - 二脒基 - 2 - 苯基吲哚），它在紫外光激发下发出蓝色荧光，便于对总细胞定位计数。最后使用抗荧光淬灭封片剂封片，在荧光显微镜下用对应滤光片观察，凋亡细胞核呈现明亮特异性荧光（绿色或红色，取决于标记物）。对于DAB显色法，TUNEL反应后需加入链霉亲和素 - HRP偶联物，再与DAB底物反应，凋亡细胞核呈现棕黄色或褐色，之后常用苏木素进行衬染，使细胞结构更清晰，便于普通光镜观察。
获取图像后，严谨分析和正确解读是得出科学结论的关键。在荧光模式下，通常在DAPI（蓝光）显示的细胞核背景中，观察TUNEL特异性信号（绿光或红光）的共定位。凋亡细胞的核形态常伴有染色质浓缩、边缘化或核碎裂成“凋亡小体”的特征，这有助于与强阳性但形态完整的坏死细胞辅助鉴别。定量分析通常通过计算凋亡指数（AI）实现，即在同一视野（或多个随机视野）下，统计TUNEL阳性细胞数占总细胞数（DAPI阳性核）的百分比。使用ImageJ、Fiji等专业图像分析软件，可通过设置阈值、分割细胞核，半自动化地进行计数，提高效率和客观性。对于流式细胞术分析的TUNEL样本（如悬浮细胞），可直接获取荧光强度的定量数据，绘制直方图并进行统计学比较。
分析时需正视TUNEL技术的固有局限与潜在假象。假阳性可能源于样本处理不当（如过度固定、剧烈消化）、坏死细胞DNA断裂、某些增殖活跃的细胞（如肿瘤细胞）存在少量DNA修复性缺口而被标记。假阴性则可能由于固定过度导致蛋白交联过紧，掩蔽了DNA末端；某些特殊类型的凋亡（如caspase非依赖性凋亡）可能不出现典型的DNA梯状断裂；或蛋白酶K消化不足，试剂无法有效进入细胞核。因此，在研究中常将TUNEL法与Annexin V/PI双染（检测凋亡早期膜变化）、活化的Caspase - 3免疫组化等技术联用，进行多参数验证，使结论更可靠。
TUNEL技术凭借原理上的普适性，在生命科学多个涉及细胞命运研究的领域广泛应用。在肿瘤研究与治疗领域，它是评估放化疗、靶向药物、免疫疗法及新型纳米药物诱导肿瘤细胞凋亡效应的关键工具。在系统性纳米颗粒递送PTEN mRNA的研究中，就使用了TUNEL凋亡检测法评估体内肿瘤生长抑制效果。在神经退行性疾病与脑科学研究方面，TUNEL是追踪神经元丢失机制的重要工具。通过TUNEL + NeuN双标实验，证实了海马刀片刺入伤模型能诱导海马神经元凋亡死亡，为后续研究该模型下的神经保护疗法提供评估指标。在发育生物学与生殖医学领域，TUNEL技术用于揭示生理性程序性死亡的时空规律。在辅助生殖技术中，可用于评估精子DNA碎片率（SDF），这是评价精子质量、预测体外受精成功率的关键指标之一，通过流式细胞术对精子进行TUNEL分析，可快速、客观地量化DNA受损精子的比例。在毒理学与药物安全性评价领域，TUNEL是评估药物或环境毒素对特定器官（如肝、肾）细胞毒性的敏感指标。在评估一种新型抗生素的肝毒性时，对给药后小鼠的肝脏组织进行TUNEL与肝细胞标志物的共染色，可定量分析肝小叶内凋亡肝细胞的数量和分布，精确判断药物损伤的部位和程度，对药物安全性优化有直接指导意义。
